抗体为基础的免疫疗法在各种类型的癌症中显示出临床有效性。然而，其靶标范围仅限于表面或可溶性抗原，而这些抗原在癌症蛋白质组中只占相对较小的比例。人类蛋白质组中的大多数蛋白质是细胞内的。而来自细胞内的短肽可以被细胞表面的MHC I类（MHC-I）分子所呈现，使其成为使其成为癌症免疫治疗的潜在目标。可以开发出针对这些肽/MHC复合物的抗体，以发挥类似TCR识别MHC-I/肽复合物的功能。这些抗体被称为T细胞受体模拟（TCRm）或TCR样抗体。

一项癌症蛋白质组研究分析了17种主要癌症类型的转录组。发现有500多个基因与正常细胞向癌细胞的转化有关，其中近一半的基因编码的是细胞内蛋白。而另外一些蛋白质表达在细胞表面，它们可以成为癌症免疫疗法的目标如mAb和CAR-T。这些细胞外蛋白包括CD19, CD20, CD22, CD47, CD52,CD80, CD123,HER2, EGFR, mesothelin, GPC3, GPC2, GD2, B7-H3和PD1/PDL1。然而，细胞内的癌症靶点并不能很好地被这些免疫疗法所利用。因此，有必要开发出能够在细胞内进行免疫治疗的药物。

细胞内的蛋白质可以被蛋白酶体降解8到10个氨基酸长的短肽。这些短肽被MHC I类（MHC）呈现在细胞表面。一些肽/MHC复合物(pMHC)已被证明与各种癌症有关，因此其可以成为TCR治疗的潜在靶标。这些复合体可以被用于开发抗体。靶向pMHC的抗体通常被称为TCR模拟（TCRm）或TCR-like抗体，因为它们能够像T细胞上的TCR一样识别复合物。肽来自于各种细胞内的肿瘤抗原如病毒性肿瘤基因产物、转录因子、胎盘蛋白、癌睾丸抗原等或来自突变的癌基因的新抗原。TCRm抗体扩大了治疗目标的范围，具有广泛的临床潜力。

肿瘤中pMHC靶标的选择

开发TCRm抗体时，pMHC的选择主要考虑以下因素：表位的丰富程度，癌细胞与正常细胞的特异性，MHC分子的表达，以及在肿瘤细胞上表达的异质性。TCRm抗体的理想目标是一个癌症特异性pMHC复合物，该复合物在目标细胞表面有很高的密度，而在正常细胞上不存在。或者是目标抗原在肿瘤生长中具有功能性甚至是关键性作用，从而避免在随后的治疗中，该抗原因治疗压力而丢失。该多肽还应该对病人的MHC有很高的亲和力，并形成一个稳定的复合物，且在肿瘤细胞表面持续表达，从而允许TCRm抗体的识别。TCRm抗体开发的一个主要挑战是肿瘤细胞往往下调MHC-I的表达。

HLA是pMHC复合物的一个主要部分，因此选择HLA进行癌症治疗非常重要。HLA I在不同的人类群体中有超过20000个等位基因。同一个癌原性的肽可能在不同的人群中中呈现有不同的HLA等位基因。因此，开发TCRm抗体时，为了能以扩大其临床应用，HLA亚型的选择应需要重点考虑。有研究表明，在白种人中最常见的HLA I类等位基因是HLA-A02, 24,01和HLA-B_35, 44, 51;而亚洲人种中为HLA-A_24, 02, 26和HLA-B_40, 51, 52; 非裔巴西人中主要为HLA-A_02, 03, 30 和HLA-B_35, 15, 44。因此，HLA-A_02是TCRm抗体开发比较理想的候选者。

根据其短肽成分的来源，pMHC复合物可大致分为以下两大类肿瘤相关抗原（TAA），包括过度表达的蛋白质，和肿瘤特异性抗原（TSA）。TSA包括肿瘤特别的融合蛋白、致癌病毒抗原和变异的自身抗原。表1中所列的抗原已被研究证明的细胞表面表达的pMHC复合物，使其成为TCR细胞治疗或CRm抗体开发的目标。目前，细胞表面的pMHC复合物的发现和验证主要是通过复杂的蛋白质组学方法，包括质谱分析等，因此目前可以靶向的pMHC复合物相当有限，这也在一定程度上限制了TCRm抗体的开发。

TAA

TAAs主要由肿瘤细胞表达，并与恶性肿瘤细胞表型相关，这是靶向癌症免疫疗法的基础。在TAAs中，异常过度表达的抗原是最大的一类，研究表明，针对部分TAAs抗原（如，癌胚胎抗原WT1，α-甲胎蛋白和在黑色瘤中表达的PRAME和NY-ESO-1等肿瘤-睾丸抗原）的一些疗法已经取得初步成功，如疫苗、过继性细胞疗法和抗体等。癌胚胎抗原WT1和AFP在胚胎发育过程中表达，并且在一些特定的肿瘤中也表达，但在健康的成人组织中的表达非常有限。癌睾丸抗原包括MAGE基因家族和NY-ESO1在几种肿瘤类型中高度表达，但在健康的成人组织中的表达几乎检测不到。这些TAAs已被充分证明，可以作为CTL，TCR-T或者TCRm抗体的有效靶标，用于肿瘤的治疗。

TSA

TSA是癌症免疫治疗比较有吸引力的靶标，因为TSA是由肿瘤细胞特异性表达的，因此免疫治疗效果仅限于肿瘤，并且能最小化脱靶导致的副反应。目前研究表明，某些融合蛋白仅在肿瘤细胞中表达，如BCR-ABL和PMMA。BCR-ABL融合（费城染色体）是由9号染色体和22号染色体之间的易位导致的。这种易位对CML的发病机制至关重要，在95%的CML患者中可以检测到，而在正常细胞中则没有。PML-RARa融合引起的易位，是急性早幼粒细胞白血病（APL）的一个标志性特征。这种易位产生的融合蛋白作为一种异常的视黄醇受体，具有异常的转录调节特性。有研究使用BCR-ABL肽作为疫苗，但是在临床中疗效有限。

另外一种TSA是致癌病毒的抗原。据统计，人类癌症中约有12%是由病毒引起的。目前已知有七种病毒可以导致癌症的发生，包括EB病毒（EBV）、人乳头瘤病毒（HPV），乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV），人类T淋巴细胞病毒1（HTLV-1）、卡波西肉瘤相关的疱疹病毒（KSHV）和梅克尔多元癌细胞病毒（MCPyV）。致癌病毒的致癌作用是复杂的，只有一小部分受感染的人会发展成癌症，而且往往是在最初感染后的许多年或几十年才发生。这些病毒的致癌基因在癌细胞中为构成性表达，因此它们成为癌症治疗较好的靶标。开发TCRm抗体治疗EB病毒相关的癌症已被证明是可行的。EB病毒与一些癌症有关，如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌。来自EBV的多肽，包括EBNA1562-570、LMP1125-133和LMP2A426-424由HLA-A0201呈现在肿瘤细胞表面，因此这些多肽成为TCR抗体的潜在目标。研究结果表明，用TCRm抗体治疗EB病毒转化的B淋巴细胞的异种移植小鼠时，这些转化细胞的生长被抑制，而且小鼠的存活率显著提高。另外，TCR细胞疗法靶向HPV E6或E7多肽复合物也取得了一定的效果。

变异的自身抗原或新生抗原是癌症免疫疗法的最佳目标，因为它们仅在恶性肿瘤细胞中表达细。然而，肿瘤突变的在肿瘤患者之间并不完全相同，只有少数患者有相同的新生抗原。在大多数情况下，针对这些不同的新生抗原开发TCRm抗体是非常困难并具有一定的挑战，因为其临床应用比较有限。幸运的是，研究发现了频发突变（recurrent mutations）（>1%的的患者），这些可能是频发性的新抗原，如P53，KRAS和 Myc。肿瘤抑制因子p53在各种癌症中失调，因此是免疫治疗的重要目标。p53在结直肠癌中有两个常见的突变R175H和R282W，突变的频率为9.5%。最近的一项研究开发了一种针对p53 R175H突变的TCRm双特异抗体。该双特异性抗体能有效地激活T细胞，并特异性的杀伤具有这种突变的癌细胞。KRAS突变在多种癌症中都比较常见，如胰腺癌(70%-90%），结肠癌（35%-50%），小肠癌（35%），胆道癌（35%），(35%），胆道癌（20%-30%）和肺癌（20%-35%）。在胰腺癌患者中，KRAS G12D是最常见的突变（32.4%），其次为G12D突变（22%）。有研究证明，靶向KRAS G12V突变肽与HLA-A3复合物的双特异抗体能对肿瘤进行了特性杀伤。

pMHC复合物的表达
 

pMHC是由HLA I类重链、b2-微球蛋白(b2M)，以及来自肿瘤抗原的肽组成的复合物。肽位于HLA分子的结合槽中，MHC分子的侧链和肽的骨架之间通过比较保守氢键相互结合。一个pMHC复合物的原生构象对于分离出一个成功的TCRm抗体至关重要。使用目前的技术，如杂交技术和噬菌体展示技术，生产pMHC复合物的抗体具有一定的挑战性，因此TCRm抗体并不像传统的抗体容易获得。

重组pMHC复合物的出现，推动了TCR抗体的发展。使用不同的策略来分离TCR抗体，首先需要相对大量的纯化的MHC-肽复合物。起初，有研究者将MHC分子的重链和b2M利用细菌单独表达并且通过包涵体纯化获得，然后，它们将MHC与肽重新折叠，产生正确的重新折叠的pMHC复合物（图2B），这些获得的复合物需要通过功能实验和其它一些实验验证复合物结构的正确性。总的来说，与其他细菌或哺乳动物表达的抗原制备相比，该方式产量很低，而且生产过程很繁琐。为了提高生产效率，有研究者将MHC重链和B2M和肽通过linker连接，并且以融合蛋白的形式表达（图3）这些重组的pMHC复合物可以被不同的TCR识别，与原生的pMHC复合物相似。结构研究显示，其与天然的pMHC复合物在结构上有一些差别，特别是在a1a2结构域。然而，在抗原结合活性上，两者的差异可能比小。最初，这些融合蛋白的主要是用于产生四聚体或其他多价染色试剂用于观察T细胞。pMHC单体的构象在四聚体的应用中可能并不重要。然而，一个原生的pMHC单体可能是TCRm抗体筛选比较理想的抗原。pMHC抗原生产的开发和优化将是TCRm抗体发现的重要研究领域。

TCRm抗体的筛选和表达

在过去，TCRm抗体的筛选比较困难。但是随着技术的进步，包括上述的pMHC复合物的表达，TCRm抗体的开发已经有了很大的进展。越来越多的针对肿瘤和病毒抗原的TCRm抗体已经被开发，包括WT1, AFP, PRAME, NY-ESO-1, MAGEA1,hTERT、TARP、Tyrosinase、hCGbeta、p53、p68 MIF、蛋白酶3，MAGE3和EB病毒蛋白。杂交瘤以及噬菌体展示进行体外筛选是目前两种主要方法（图2A）。另外，单个B细胞分选和克隆也逐渐成为TCRm抗体筛选的一种选择。杂交瘤技术的主要优点是，其分选到的TCRm抗体可能对pMHC复合物有较高的高亲和力，这是因为这些抗体在免疫过程可能经历过亲合力成熟的过程。然而，该方法需要稳定的MHC复合物与肽有较高的亲和力，因为这是免疫有效的前提，而且是抗体成熟中所必须的。另外，通过这种方法筛选的抗体进入临床实验，也必须进行人源化，以消除抗体的免疫原性。

噬菌体展示技术很大程度的促进了TCRm抗体筛选的成功。在分离TCRm抗体方面取得了成功。特异性对于TCRm抗体的成功很重要，噬菌体展示可以结合阴性和阳性筛选来分离出高度特异性的TCRm抗体，而杂交瘤通常不能做到这一点。噬菌体展示的另一个重要特点是抗体库通常具有很大的多样性。抗体可以Fab或者scFv的形式展示在噬菌体颗粒上。该方法的主要优点是可以对目标进行广泛的选择并且在短时间内获得目的抗体。另一个优点是，其可以产生完全人源化的抗体，因此无需进行人源化。然而，来自噬菌体库的TCRm抗体的亲和力通常具有较低，因此可能需要亲和力的成熟。

TCRm抗体与pMHC复合物结合的方式决定了其性质

TCRm抗体与pMHC复合物结合的结构信息对开发针对不同患者群体的治疗方法很有价值。TCRs与pMHC复合物的亲和力在1到100mmol/L之间，而TCRm抗体可以有更高的亲和力。例如，ESK1，一种针对WT-1的TCRm抗体，其对WT-1具有亚纳摩尔的亲和力，比天然TCR的亲和力高1000倍。与TCRs和其他TCRm 抗体对pMHC复合物的结合方式相比，ESK1具有不同的模式（图4）。ESK1的可变区结构域结合在HLA区域是TCRs无法触及的区域。此外，ESK1结合部分多肽，而这些多肽只占总的pMHC接触面的15%。肽上的结合比例在各种TCRm抗体中是不同的。最近发表在Science上的一项研究表明，H2-scDb抗体与肽和HLA-A02都有结合，并且与两者的接触面分别占50%左右（图5）。此外，晶体结构研究显示，ESK1与HLA受体和多肽的结合率高达85%。有趣的是，这个区域在HLA-A02亚型之间是比较保守的。因此可以推测，ESK1可以与HLA-A02家族的其他亚型结合，并且这种推测已经通过亲和力实验得到验证。这潜在地扩大了具有不同HLA-A02亚型的目标病人群。除了基于可溶性TCR的构建体和TCR工程细胞外，基于TCR的药物的一个主要限制是，它们对特定HLA亚型的限制。结构上的发现表明ESK1可能可以克服HLA亚型限制的限制。因此，TCRm疗法可能有比基于TCR的药物有更广泛的治疗应用。

TCRm抗体在治疗中的应用

TCRm抗体为癌症治疗提供了新的基于抗体的免疫治疗的方法。表2列出了已经被报道的用于肿瘤治疗的TCRm抗体。从筛选方式上来看，基本上所有TCRm抗体都是通过噬菌体展示和杂交瘤筛选。

与传统的抗体药类似，TCRm抗体通过抗体依赖性细胞细胞毒作用（ADCC），细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）或补体依赖性细胞毒性（CDC）等发挥作用。在研究中，可以使用不同的方法，包括增强ADCC、ADCP、工程双特异性mAbs、免疫毒素、抗体药物结合物（ADC），以及与其他治疗方式相结合等，提高TCRm的药效。例如，经过改造的ESK1抗体ESKM，增强了对FcgR的结合和减弱了对FcgRIIb的结合能力，从而抗体的ADCC效应。此外，ESKM可以和各种酪氨酸激酶抑制剂的联合使用提高治疗效果。

TCRm抗体同样也可以被开发用于CAR T细胞治疗。CAR主要由特异性的细胞外抗体部分、铰链区、跨膜区和细胞质区（包括CD3 zeta链和一些共刺激结构域）组成。一些基于TCRm抗体构建的CAR-T已经被报道，如利用WT1 抗体构建的CAR-T已经在体外和体内实验中取得疗效；同时也有研究者构建靶向gp100 pMHC复合物的CAR-T疗法，用于治疗黑色素瘤。. 由这种TCRm衍生的CAR T细胞显示了对肿瘤的特异性细胞毒性，并在异种移植模型中抑制了黑色素瘤的生长。目前，AFP CAR-T细胞疗法是进展最快的基于TCRm抗体构建的CAR-T疗法，正在进行临床试验（NCT03998033）。该疗法由Eureka开发，在临床前研究中，该疗法在多种肝癌模型中取得了较理想的结果。

TCR融合蛋白

当然，除了利用抗体结合pMHC复合物外，immunocore公司开发了TCR融合蛋白+抗体的ImmTAC平台，该平台中，改造后的融合蛋白以更高的亲和力与pMHC（HLA）复合物结合，而其抗体部分通过与T细胞表面的CD3结合，从而激活T细胞对肿瘤细胞进行杀伤。目前基于该平台构建的Tebentafusp（靶向HLA-A*02:01和gp100复合物）已经位于临床Ⅲ期，并且预计今年第三季度申请BLA。

总结
 

TCRm抗体目前大多数都处于临床前。而且TCRm抗体的开发仍然面临着几个重要的挑战。首先是pMHC复合物表达，生产足够多的高质量pMHC复合物既费时又费力。其次，脱靶效应可能阻碍了TCRm抗体治疗的应用，因为多数pMHC复合物可能不只在肿瘤细胞中表达，而且可能在正常组织中表达量很低。此外，因为pMHC中的肽都比较短，TCRm抗体可能与其pMHC复合物存在交叉反应性。而单域抗体也许可以解决以上问题，与其它抗体相比，单域抗体较小，而且仅有重链，因此可以深入到pMHC结合肽的“沟”中，从而特异性结合肽与pMHC的构象型表位，另外，单域抗体可以很容易的构建双表位的抗体甚至三表位的多特异性抗体。最后一个挑战是，细胞表面的MHC-I复合物的表位密度低，以及抗原表达的下调并造成耐药性。现在有一些可能的方法可以用来解决这一挑战，如增加肿瘤中pMHC-I的表达，或者使TCRm抗体对低密度表位更加敏感，或者与其他药物联合治疗，以及设计双特异性的TCRm抗体等。

TCRm抗体可以将抗原范围扩大到细胞内的蛋白，并有可能使许多 "不可成药 "的靶标可用于免疫治疗。尽管还需很多努力来分离出特异性好的的TCRm抗体，但它们在靶向细胞内蛋白方面具有很好的治疗潜力。分离出更多针对现有的抗原或者新的抗原的TCRm抗体，改进pMHC复合物的生产，TCRm抗体的研究，包括单域抗体的使用，抗体传递，结构研究，以及TCRm的亲和力成熟和减少TCRm抗体的免疫原性将推动针对细胞内靶标的治疗并有可能在未来将有效的抗体推进到临床应用。

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