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单克隆抗体中的酸性和碱性种类

  • 分类:行业新闻
  • 作者:BPI-MW
  • 来源:生物制品圈
  • 发布时间:2021-10-29

单克隆抗体中的酸性和碱性种类

  • 分类:行业新闻
  • 作者:BPI-MW
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  • 发布时间:2021-10-29
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存在电荷、分子量或其他性质不同的多个变异体是单克隆抗体(mAb)的共同特征。与主要物种相比,这些电荷变体通常被称为酸性或碱性。主要物种的化学性质通常是众所周知的,但了解酸性和碱性变体的化学性质,以及这三个物种之间的差异,对于工艺开发和配方设计至关重要。然而,完全了解酸性和碱性物种是具有挑战性的,因为已知这两个物种都包含多种修饰。本文将简单介绍用色谱技术分离的酸性和碱性物种的表征,及其对抗体结构、稳定性和生物学功能的影响。

 

基于电荷的分离技术

由于多个翻译后修饰和降解事件,单克隆抗体(mAb)的生化和生物物理特性具有异质性。用等电聚焦凝胶电泳(IEF)、毛细管等电聚焦(cIEF)凝胶电泳、阳离子交换层析(CEX)和阴离子交换层析(AEX)等基于电荷的分离技术分析mAb时,经常会观察到变异。与主要物种相比,这些变体通常被称为酸性或碱性物种。当用基于IEF的方法分析抗体时,酸性物种是表观等电点较低的变体,碱性物种是表观等电点较高的变体。当用基于色谱的方法进行分析时,酸性物种和碱性物种是根据它们相对于主峰的保留时间来定义的。酸性种是早于CEX主峰或晚于AEX主峰洗脱的变体,碱性种是晚于CEX主峰或早于AEX主峰洗脱的变体。

虽然人们普遍同意使用基于离子交换和色谱的方法观察到的酸性和碱性物种的分布和数量,但由于分离机制的不同,可能存在细微的差异。IEF根据总电荷差(表观PI)来分离抗体变体,但除了总电荷外,电荷分布在层析分离抗体变体中起着关键作用,因为它可能会影响抗体与柱树脂的相互作用。例如,当用IEF分析时,具有两个重链上的天冬氨酸(Asp)或一个重链上的一个天冬氨酸(Asp)和另一个重链上的一个异门冬氨酸(IsoAsp)的重组单抗在IEF分析时具有相同的等电点,因此,没有预期的等电点差异,然而可以通过强阳离子交换(SCX)柱来分离。这表明,基于色谱的分离并不仅仅依赖于总电荷,因为即使在没有电荷差异的情况下也可以实现分离。因此,尽管分离的主要驱动力是电荷差,但基于理论计算或基于IEF方法的实验确定的表观等电点可能不足以预测色谱分离方法的洗脱顺序。

主要物种

主要种类是在色谱图上作为主峰洗脱的抗体。主要种类不一定对应于未修饰或未降解的抗体。事实上,主峰通常由三种典型的翻译后修饰的抗体组成:(1)N-末端谷氨酰胺(Gln)环化为焦谷氨酸;(2)去除重链C-末端赖氨酸(Lys);(3)CH2结构域中保守的天冬酰胺(ASN)残基与中性寡糖的糖基化。N-末端谷氨酰胺编码在轻链和重链中的一条或两条基因中,合成后可以自发环化形成焦谷氨酸(PyroGlu)。大多数抗体在分析时含有N-末端焦谷氨酸,而不是原来的谷氨酰胺,因此洗脱为主峰。类似地,重链C-末端赖氨酸也编码在重链基因中。羧肽酶对C端赖氨酸的不完全去除会导致抗体中没有、有一个或两个C端赖氨酸残基。主要品种通常为没有任何C端赖氨酸的抗体。CH2结构域中保守的ASN残基被N-连接的寡糖糖基化。哺乳动物细胞培养的重组mAb的主要糖型为核岩藻糖基化的复合双天线结构,其末端有0、1或2个半乳糖残基。

酸性物种

酸性物种被定义为在CEX分析中早于主峰或在AEX分析中晚于主峰的抗体变异体。图1总结了酸性物种形成的主要原因。

唾液酸通常被报道有助于酸性物种的形成。在NS0细胞中表达的重组IgG1抗体的酸性组分中检测到唾液酸。在CHO细胞系中表达的重组IgG1抗体的酸性组分中也含有较高水平的唾液酸。用唾液酸酶处理后,发现酸性物种的百分比大大降低,这表明唾液酸的存在是这些酸性物种的主要原因。

ASN残基的脱酰胺化也被广泛报道为酸性物种的主要原因。脱酰胺化既发生在可变区,特别是在暴露的和灵活的互补决定区(CDR),也发生在恒定区(图2)。CDR区ASN残基的脱酰胺化几乎肯定会导致酸性物种的产生。虽然isoAsp和Asp侧链上的PKA差异很小,但轻链CDR1上带有isoAsp33的抗体及其Fab片段的洗脱时间要晚于相同位置上带有Asp33的抗体,而且两者都比含有原始ASN残基的抗体洗脱得更早。具有相同位置的 isoAsp 或 Asp 的抗体在不同保留时间洗脱的事实表明影响电荷分布的构象差异,因此是抗体与柱树脂相互作用的证据。CH2区的与氨基酸序列LNGK, CH3结构氨基酸序列SNGQPENNYK和 LHNHYTQK,以及轻链恒定区LLNNFYPR的脱酰胺化也已报道。

虽然不像唾液酸和脱酰胺化那样被广泛观察到,但其他修饰也被证明会导致酸性物种的产生。例如,当使用AEX分析时,含有三硫键的抗体(最先在重组人IgG2中发现)比主峰洗脱得晚,因此对应于酸性种类。一种高甘露糖含量的抗体变体也在重组mAb的酸性部分中略有富集,尽管高甘露糖低聚糖和具有核心岩藻糖的复杂双天线低聚糖之间没有电荷差异。这再次强调了基于色谱的分离不仅仅基于电荷差异。糖基化,还原糖与赖氨酸残基的侧链或N-端伯胺之间的反应,由于正电荷的中和,导致酸性物种的形成。

酸性种类对结构、稳定性和功能的影响

由于导致酸性物质产生的各种修饰对结构、稳定性和功能的潜在影响高度依赖于它们的位置。由于柔性铰链区,位于Fc区的修饰可能不会对Fab片段产生显著影响。例如,唾液酸的存在不会影响抗体效力。位于Fab区的修饰,特别是CDR区的修饰,最有可能对抗原结合和效力产生实质性的影响。图3总结了脱酰胺化的影响。铰链区的三硫键的存在已被证明不会影响IgG2抗体的热稳定性。Lys糖基化可以在不改变抗体构象的情况下增加聚集体的形成,这表明Lys糖基化引起的表面正电荷减少可能会降低抗体分子之间的排斥力。抗体重链 CDR2 中 Lys 残基 (K65) 的 10% 糖基化不会影响其结合亲和力。

碱性物种

碱性物种被定义为在CEX分析过程中晚于主峰、在AEX分析过程中早于主峰洗脱的物质。图4总结了导致碱性物种产生的修饰。形成碱性物质的一个主要原因是C末端Lys的不完全去除。由于额外的正电荷,具有重链C-末端Lys的mAb比主要物种更碱性。羧肽酶B(CPB)能特异性去除C端碱性氨基酸残基,对比CPB消化前后抗体的色谱图,可以清楚地证明C端赖氨酸对碱性物种形成的贡献。

对碱性物种有贡献的另一种常见修饰是轻链或重链的N-末端谷氨酰胺(Gln)不完全环化为焦谷氨酸,或两者兼而有之。谷氨酰胺最初是在基因中编码的,但它可以发生自发反应,产生焦谷氨酸(PyroGlu)。含有原始谷氨酰胺的抗体具有比主要物种更高的表观等电点,因此被称为碱性物种。

天冬氨酸异构化已被广泛报道。与脱酰胺化类似,异构化在CDR区域频繁发生,很少在恒定区发生。当用CEX分析时,重链CDR3中含有isoAsp102的重组单抗比含有原始天冬氨酸的抗体洗脱得晚。琥珀酰亚胺是天冬酰胺脱酰胺化和天冬氨酸异构化的常用中间体,也有助于碱性物种的产生。CDR区琥珀酰亚胺为天冬氨酸异构化产物的重组mAb的洗脱时间晚于CEX相同位置天冬氨酸的抗体洗脱时间。以琥珀酰亚胺为ASN55去酰胺化产物的抗体在CEX的碱性区域洗脱出重链CDR2。琥珀酰亚胺作为天冬氨酸74异构化产物存在于CDR区外,也导致碱性物种的形成。

其他几种修饰也能产生碱性物种。Fc区两个保守蛋氨酸(Met)残基氧化的抗体在碱性区域洗脱。mAb CDR2区域的Met残基也会导致碱性物种的产生。除去重链C-末端赖氨酸和前一个甘氨酸残基后的脯氨酸残基的酰胺化也可导致碱性物种的形成。重链可变区有未形成二硫键的重组mAb比CEX柱上有完整二硫键的抗体洗脱得晚,因此代表一个碱性物种。具有一个糖基化重链和一个带有短寡糖的重链的抗体也从CEX中晚洗脱出来作为碱性物种。一个非共价Fab-Fab二聚体在WCX-10柱上的洗脱时间晚于Fab单体。抗体聚集体和片段已被检测为碱性物种。由于碎片也以酸性物种的形式富集,碎片的电荷性质可能在影响其色谱洗脱顺序方面起着关键作用。

碱性种类对结构、稳定性和功能的影响

与关于酸性物种类似,形成碱性物种修饰的位置是否对结构、稳定性和生物功能有任何影响是至关重要的。抗体的N端或C端的修饰不会对抗体的结构、稳定性和功能产生实质性的影响,因为这些区域是高度暴露的,并且不是任何配体结合位点的一部分。含有两个重链N-末端焦谷氨酸的抗体效价与含有一个焦谷氨酸和一个谷氨酰胺的同一抗体的效价没有差异。C-末端赖氨酸不影响重组IgG1抗体的热稳定性,也不影响补体依赖性细胞毒(CDC)介导的效价。去除Lys和Gly后C末端脯氨酸残基的酰胺化对抗原结合或Fc效应功能没有影响。

与N-末端或C-末端区域的修饰相比,其他区域的修饰更有可能对结构、稳定性和生物功能产生实质性影响。具有不成对的二硫键的FAB的效力仅为含有完全形成的二硫键的FAB的~28%。以isoAsp102为异构化产物的含有抗体的分离组份的效价仅为含有原始Asp102残基的主峰组份的9-21%。

一些研究已经证实了琥珀酰亚胺的形成对抗原结合亲和力和效力的影响。有研究报道,与具有原始 Asn 残基的 Fab 相比,在重链 CDR2 中包含琥珀酰亚胺 55 的 Fab 片段显示出结合亲和力降低 50%,与具有原始 Asn 残基的抗体相比,具有琥珀酰亚胺的抗体的效力降低了 70% 。在轻链CDR1中具有琥珀酰亚胺32的Fab具有16%的结合亲和力和~42%的效力。

Fc区Met残基的氧化不影响重组mAb的抗原结合力和效价;然而,它确实引起了构象变化,主要是在CH2结构域,导致热稳定性降低和聚集倾向增加。由于两个Met氧化位于多个配体的结合位点附近,这些残基的氧化减少了与蛋白A、蛋白G和FcRn的结合,但对Fcγ受体结合的影响很小。此外,这些Met残基的氧化导致体内半衰期显著缩短。差示扫描量热法(DSC)测定重链CDR2区Met残基的氧化导致抗体热稳定性降低。

酸性物种和碱性物种的表征策略

虽然馏分收集几乎是彻底表征酸性和碱性物种的第一步,但在馏分收集之前通过酶消化确定唾液酸对酸性物种的贡献和C-末端赖氨酸对碱性物种的贡献可能是有益的。唾液酸和C-末端赖氨酸都可以在自然条件下被酶消化特异性地去除,而这种条件不会对抗体结构产生实质性的影响。单独使用唾液酸酶可以很容易地去除唾液酸,或者使用PNGaseF可以很容易地与整个N-连接的寡糖一起去除唾液酸。C端赖氨酸可以通过CPB消化很容易去除。比较这些酶处理后酸性或碱性物种的百分比,将确定这些修饰对酸性或碱性物种总数的贡献。

在许多情况下,加速样本被用来产生更高水平的酸性或碱性物种,用于馏分收集。数据然后外推,以确定在非加速药物物质中存在的极低水平的酸性和碱性物种的性质。然而,观察到药物物质和加速样品中的酸性物种和碱性物种具有相同的保留时间,这可能也不足以支持它们是由于相同的修饰而形成的结论。通常需要进一步的证据来证实在不同条件下产生的酸性物质和碱性物质在性质上是相同的。即使修改的性质相同,机制也可能不同。例如,Met256和Met432的氧化。两种残基都被氧化或者它们都不在药物物质中的一条或两条重链上并且在加速稳定条件下被氧化。然而,常用的tBHP化学氧化导致两个重链上的两个Met残基被随机氧化。

控制分析人工产物的水平对于表征酸性和碱性物种也是至关重要的。在收集碎片和准备样品以进行详细分析时,可以很容易地引入人工制品。首先,在馏分的收集、浓缩、缓冲液交换和储存过程中,不能完全避免将馏分暴露在不同的pH、搅拌、室温和冷冻/解冻循环中。因此,诸如聚集、氧化和脱酰胺化之类的修饰可以作为人工产物产生。

小编总结

在单抗产生过程中,常可观察到酸性和碱性物种。完全消除酸性和碱性物种是不切实际的,也是没有必要的。有一些可能是重组单抗所特有的修饰,它们或者与特定的宿主表达系统相关或者发生在生产和配制过程中(例如,硫代硫化物修饰)。对生物功能的影响高度依赖于修饰的部位和水平。对于定位于Fc区域的修饰,即使存在更高水平的修饰也可能不会对结合亲和力产生直接影响。同样,定位于Fab区的修饰可能不会影响Fc相关功能,如受体结合。然而,在许多情况下,完全理解酸性物种和碱性物种的性质仍然是具有挑战性的。在任何情况下,都有必要评估酸性或碱性物种与主峰在稳定性和功能方面的差异。修饰可能是关键质量属性(CQA)或关键过程属性(KPA)。因此,酸性和碱性物种的信息对于建立与最终目标的可比性和相似性至关重要,以确保治疗性重组mAb的有效性和安全性。

参考文献

1. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies.

2. A new tool for monoclonal antibody analysis.

3. Charge-based analysis of antibodies with engineered cysteines.

4. Characterization of N-Linked glycosylation in a monoclonal antibody produced in NS0 cells using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.

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