截至目前已经有5款双特异抗体获批上市，Catumaxomab（CD3/EpCAM,已经退市），Blinatumomab（CD3/CD19）、Emicizumab(FIX/FX)，强生的amivantamab-vmjw（EGFR/cMET）和罗氏最近获批的Faricimab(Ang2/VEGF)。这些双特异抗体的成功极大的刺激了双特异抗体的发展，目前在国内也已经有多家企业具有原创的双特异抗体平台，并且已经有超过100款双抗在国内申报临床，可以说双抗的发展已经逐步进入高潮。但是随着技术的进步，机制的探索，目前三抗技术已经悄然出现。与双抗的双靶点相比，三抗使得抗体的组合更加丰富多样，也为抗体药药物的发展提供了更多的空间。本篇文章我们介绍一些三抗的构建技术及平台。

Merck三抗或者多抗平台

近日，merck及其合作者在MABS上发表了其三抗或者多特异抗体构建技术，其以防止重链错配的CEED技术为核心，搭配cFAE(Fab arm exchange，Genmab的体外双抗重组技术，在两个链重链上分别进行 F405L 和K409R突变，在体外通过还原氧化条件进行双抗组装)技术，同时在抗体的C末端进行其它靶点抗体的融合。

罗氏的三抗平台

罗氏目前已经发表三种具有潜力构建三抗的平台技术，其中最Contorsbody平台，该技术利用抗体的VH和VL替换CH2结构域，搭配Knob-In-Hole技术，可以构建结合三个不同靶点的TriFab-Contorsbody。

同样以此技术为核心，其最近还设计了能够在肿瘤中进行富集激活的PACE（Prodrug-Activating Chain Exchange）平台，该平台利用了前药的概念，可以使得抗体在肿瘤细胞表面富集，并通过链的交换形成有功能的抗体，从而在避免相关副作用的前提下，使抗体发挥药效。

Zymeworks的ProTECT

ProTECT^TM为Zymeworks的新一代多特异抗体平台，是在双特异抗体的基础上，融合了可以激活免疫系统的相关供体/配体蛋白，如PD-1/PD-L1，CTLA-4/CD80, CD28/CD80, PDL-1/CD80, ICOS/ICOSL,CD47/SIRPa等，该技术中的部分融合蛋白在肿瘤微环境中可以被肿瘤组织中的特异酶进行切割，从而暴露其它抗原的结合位点，如CD3的结合位点等，使得抗体能够激活T细胞发挥相关作用。

赛诺菲三抗

赛诺菲的三抗是以CODV-Ig平台为核心进行构建，目前NIH和赛诺菲联合开发的SAR441236的三抗应该是最早进入临床的三抗，该抗体结构如下图所示，其中融合三种广谱中和抗体：VRC01， PGDM1400和10E8v4，三者别与病毒的CD4bs，V1V2多糖位和MPER结合，目前该抗体已近位于Ⅰ期临床。除此之外，三诺菲利用还开发了CD28/CD3/CD38的抗肿瘤三抗SAR442257，同样也已经进入临床。

GT-Biopharma的TriKE平台

TriKE平台是以激活NK细胞为核心进行构建，其利用靶向CD16的纳米抗体结合并激活NK细胞，结合肿瘤抗原的纳米抗体结合肿瘤细胞并将肿瘤细胞和NK细胞进行桥接，利用NK细胞对肿瘤细胞进行杀伤，在此基础上，融合了能够刺激NK细胞进行活化扩增的IL-15

Innate Pharma的NKCE平台

NKCE平台同样以激活NK细胞为核心，不同的是其靶向NKp46激活NK细胞，在此基础上该平台同时融合了FC（可以结合CD16并激活NK细胞，同时其还可以延长抗体的半衰期），和IL-2v（促进NK细胞的增值）

Revitope的TEACs技术平台

TEACs技术是由Revitope开发的在肿瘤微环境中特异性激活的抗体平台，

其设计如下图所示，结合CD3的抗体被一分为二，并利用多肽链进行结合以增加抗体的稳定性，在肿瘤微环境中，结合CD3的VH和VL被暴露并相互配对，形成具有功能的CD3，在结合肿瘤抗体的桥接下，利用T细胞对肿瘤细胞进行杀伤。

Molecular Partners的DARP技术平台
 

确切的讲DARP技术并不是真正意义上的抗体，其核心结构为DARPins蛋白，DARPins是人体基因组表达最丰富的结合蛋白之一，与其它重复蛋白类似，其含有由不同数目重复序列构成重复蛋白结构域，其主要功能是与靶蛋白结合，从而导致不同作用模式，如酶抑制剂，蛋白之间的锚定等。DARPins其除了含有重复序列结构域外，还有N端的帽子和C端的帽子，主要用来稳定重复序列结构域。其中间的重复序列结构域的数量可以变化，一般为4-6个，因此其分子量大小为14-21KDa，较小的分子量使得其可以串联多个不同功能的DARPins，并进行相关治疗。

基于mAb2的三抗

近期有研究者依据F-star的mAb²平台并搭配cFAE(Fab arm exchange)技术构建了能够结合三个不同抗原的三特异抗体。该技术对抗体的CH3的末端进行修饰改造，使其可以结合抗原，并进行 F405L 和K409R突变方便后期在体外进行抗体组装。

Merus的Triclonics平台

Triclonics平台是在Biclonics®双抗平台上的改进，该平台结合靶点的形式可以是2+1或者是1+1+1。与双特异抗体平台相似，该平台同样采用了共同轻链防止重链与轻链的错配；为了防止重链错配，采用了DEKK突变。

Mcrogenics的TRIDENT平台

TRIDENT是在DART双特异抗体平台上的改进和发展，其在DART的基础上加入了抗体的Fc从而可以增加抗体的半衰期，另外，其同时加入正常抗体的Fab，因此该抗体平台可以根据需要进行多种调整，既可以形成2+1的双特异抗体，也可以形成1+1+1型的三特异抗体。

恩沐生物的三抗平台

恩沐生物双/多特异抗体的构建策略是利用两个抗体可变区对其中一个Fab替换，如下图（左）所示，其中H1和L1为第一个抗体的VH和VL，H2和L2为第二个抗体的VH和VL，为了增加抗体VH和VL的正确配对，在H2和L2上进行二硫键突变和正负电荷氨基酸突变。

该双/多特异抗体抗体平台在大小上和常规IgG抗体相差不大，但是可以形成2+1或者1+1+1型的多价抗体（下图右，右侧为正常的Fab）。

百利药业多抗

百利药业的四特异抗体平台是以完整的IgG抗体为基础，然后在抗体的N末端和C末端融合响应的scFv，该抗体平台从分子量上来看是目前双抗平台中最大的一个，而且抗体中含有多个scFv，因此后期工艺的开发可能也比较具有挑战。

总结

三特异抗体或者多特异抗体是在双特异抗体基础上的发展，因此对于具有双特异抗体的平台（特别是具有Fc的双抗平台）的企业，其后期的结构设计相对比较容易，因为三特异抗体可以在双特异抗体的基础上融合VHH，scFv或者Fab。三特异抗体在作用机制上的设计可能比双抗要更难，因为需要更多的考虑不同靶点的协同，不同靶点的在抗体上的位置等等。